为鼓励节约能源 美数个城市开展"停电1小时"活动

研究人员认为至少在5年内这种治疗可用于患者。

转型中的人群往往开始的时候是盲从的，而且心理是波动的。这样的循环才是有序的、合理的。

转型无处不在，转型充满未来，转型吐故纳新。中国医药市场前景广阔，中小型药企如何才能抓住机遇找到自己的位置？图） 案例创新下的陷阱 C药企的产品基本分两路，一路走高端，依靠招商。生存的根基动摇了，3~5年后药企是否还存在就是个问题了。多数销售人员虚报外聘人员数目，把费用装进自己腰包，仍旧依靠商业渠道铺货。更现实的原因在于，C药企虽然独立经营，但从属于一家涉及房产、化工行业的大集团，高层变动频繁，难以改变营销现状。

外聘人员的底薪由C药企负责，某市的销售回款额视前几年的销售状况而定，完成任务后有增量提成。一路走商业，依靠渠道，两条路都必须依靠代理。(2) dsRNA 的导入方法不同的生物体可以选择不同的方法。

将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制( posttracriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。在这之前,曾利用反义RNA 与靶mRNA 序列互补的特性来抑制其表型的发生,但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱,往往会产生一些过渡表型,易造成对基因功能判断错误,目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物Vitravene。iRNA 可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可进入上述循环. 这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(random degradative PCR) . 新生的dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的siRNA ,从而使靶mRNA 渐进性减少,呈现基因沉默现象. RdRp 一般只对所表达的靶mRNA 发挥作用,这种在RNAi 过程中对靶mRNA 的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能. 每个细胞只需要少量dsRNA 即能完全关闭相应基因表达,可见RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征。RNAi 技术的应用,不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学) 的发展,还有可能设计出RNAi 芯片,高通量地筛选药物靶基因,逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域,用RNAi 技术来抑制基因的异常表达,为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。

并不是所有的mRNA 均对RNAi 敏感。还有浸泡法、工程菌喂养法、磷酸钙共沉淀法等。

为确保靶基因表达的有效抑制,最好同时合成两个或以上的针对同一基因的不同靶区域的dsRNA ;而且,标记dsRNA 正义链的3端对RNAi 现象并没有影响,现有的实验尚未发现mRNA 的二级结构对RNAi 有任何显著的影响。而Pachuk 等则提出了肌注的方法,将针对IL－12 的siRNA 的质粒表达载体导入小鼠体内,得到的RNAi 效应更持久。Paddison 等提出类似的结构也可应用于长片段dsRNA (500 左右) ,而不会引起RNA 非特异性的降解。选择与靶mRNA 上序列互补的21～23 个核苷酸长度的片段,以AA 开头为佳,因为此法能简化dsRNA 合成过程,降低成本,而且合成的dsRNA 能更好地抵抗RNA 酶的降解。

最新的研究进一步揭示,ATP 在siRNA 介导的RNAi 中具有重要作用. 较长dsRNA 向siRNA 的转变要有ATP 参与. siRNA 与蛋白因子形成一个无活性的约360 kD 的蛋白PRNA 复合体;随之, siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA 复合体(RISC) ,此步具有ATP 依赖性. RISC 活性复合体对靶mRNA 的识别和切割作用,这一步可能不需ATP参与。此外,ATP 使siRNA 5端带上磷酸分子,且对siRNA 的功能具有重要作用. 上述过程中siRNA 双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它辅助因子,含有siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA 分子。三，RNAi的应用前景 RNAi 技术中的相关问题主要涉及以下几点： (1) dsRNA 序列的选择dsRNA 主要选自已知的cDNA 的开放阅读框架(ORF) 中的基因区域。转录发夹样siRNA 的模板必须与载体转录启动子紧密相连,而且尽可能有最短的多聚腺苷酸尾巴,这样才能诱导高效的RNAi 效应。

通过实验手段将dsRNA 分子导入细胞内, 特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA ,封闭内源性基因表达,从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。过去认为, 哺乳动物细胞中不存在RNAi 现象,因为较长的dsRNA 在哺乳动物细胞中能诱导IFN(干扰素) 生成,并激活STAT 途径参与的PKR(dsRNA 依赖性激酶) 的转录,同时dsRNA 本身与PKR 结合也能令其激活,继而磷酸化翻译起始因子eIF2a 使之失活,导致非特异性的蛋白质合成障碍;另一方面,dsRNA 又能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的2,5腺苷合成酶,生成 2,5腺苷酸,激活非特异性的RNA 酶L ,发生非特异性的RNA 降解效应。

一．RNAi的发现 早在1990 年进行转基因植物有关研究时偶然发现,将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不能表达,但这些基因的转录并无任何影响,并将这种现象称为基因转录后沉默(posttracriptional gene silencing ,PTGS) . 1996 年在脉孢菌属(Neuroora) 中发现了相似现象,只不过将这种现象命名为基因表达的阻抑作用(quelling) . 首次发现dsRNA 能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elega 的研究。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA 已经足够完全阻断同源基因的表达。

有人提出了以质粒或病毒为载体,通过转导或转染途径,在细胞内以DNA 为模板,利用RNA 聚合酶Ⅲ,转录为siRNA(直接形成双链或通过回文序列折叠后形成发夹结构) ,也能产生较明显的RNAi 效应。miRNA 与siRNA 的区别： miRNA是单链的，而siRNA则是双链的。现已初步阐明RNAi 的作用机制. RNAi 的第一步是,dsRNA 在内切核酸酶(一种具有RNase Ⅲ样活性的核酸酶) 作用下加工裂解形成21～25 nt 的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA ,即siRNA.果蝇中RNase III 样核酸酶称为Dicer. Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在Arabidois , C. elega , Schizosaccharomyces pombe 以及哺乳动物中也存在Dicer 同类物. RNAi 的第二步是,由siRNA 中的反义链指导形成一种核蛋白体,该核蛋白体称为RNA 诱导的沉默复合体( RNA induced silencing complex , RISC) , 由RISC 介导切割靶mRNA 分子中与siRNA 反义链互补的区域,从而达到干扰基因表达作用. RISC 由多种蛋白成分组成,包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 链搜索活性等. 线虫C. elega中的MUT7(一种RNase D样蛋白) 可能是一种35外切核酸酶. 此外, PAZiwi 蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分,如Arabidposis 中的AGO1 ; N.Craa 中的QDE; C. elega 中的RDE1 等,以上这些蛋白与翻译因子eIF2C 同源。现在发现, 只要dsRNA 短于30 ,就不会促发干扰素效应,同时又能特异性地降解mRNA ,引起基因沉默,说明dsRNA 在哺乳动物细胞中也能发挥一定作用,为以后的基因治疗等RNAi 应用领域提供了新的研究方向。他们将这种现象称为RNA 干扰。这个奇怪的现象直到3年后才被解开华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello 首次将双链dsRNA 正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。

简单生物,如单细胞生物等,可选用电穿孔的方法; 较复杂生物可选用dsRNA 微注射入生殖细胞或早期胚胎,线虫也能采用肠道或假体腔注射的方法,与微注射相比,RNAi 效率上并无显著差别。RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。

RNAi 技术与之相比,特异性更高,作用更迅速,副反应小,在有效地沉默靶基因的同时,对细胞本身的调控系统也没有影响。RNAi 的应用领域及前景：RNAi 是一种高效的特异性强的基因阻断技术,近年来发展迅速,很快就成为功能基因组研究的有力工具。

因而直接选用其下游的产物分子siRNA 来代替,达到基因研究的目的。这为检测哺乳动物细胞中经过长期发育后的基因功能提供了新的途径。

1995年康乃尔大学的研究人员Guo 和Kemphues 尝试用反义RNA 去阻断par－1 基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA 的确能够阻断par21基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA 作为对照,也同样阻断了基因的表达。另外,尽量使dsRNA 序列中的GC含量接近50 %(45 %～55 %最佳) ,高GC 含量能明显降低基因沉默的效应。此类结构可由具有回文序列的核苷酸链形成。miRNA参与正常情况下生长发育基因调控，而siRNA不参与动物体的正常生长，只有在病毒或其它dsRNA诱导情况下才产生siRNA,作为miRNA的完善和补充。

关键词：进展研究基因dsRNA RNAi siRNA RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，A，酪蛋白等） 二抗浓度过高 降低二抗浓度 检测过程中膜干燥 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 曝光过度 缩短曝光时间 抗体与阻断蛋白有交叉反应 检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。

通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 一抗失效 选择在有效期内抗体。Western Blot过程中常见的问题及可能原因分析 2011-08-10 17:49 · Chasel 常见的问题及可能原因分析 问题 可能原因 验证或解决办法 背景高 膜没有完全均匀湿透 使用100% 甲醇浸透膜5-10min 洗膜不充分 增加洗液体积和洗涤次数 阻断不充分 增加封闭液孵育时间，或者提高温度。

洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 没有阳性条带，或者阳性条带比较弱 抗体染色不充分 增加抗体浓度，延长孵育时间 酶失活 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。换用不同封闭剂类型 曝光时间过短 延长曝光时间 条带位置不对。

降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 转移时间不够 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 抗体染色不充分 增加抗体浓度，延长孵育时间 标本中靶蛋白含量太低 增加标本上样量。HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 抗体活性降低 选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 封闭过度 减少封闭剂的量或缩短时间。并选择现配现用的工作液 HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 膜没有完全均匀湿透 使用100%甲醇浸透膜 靶蛋白分子量小于10Kd 选择小孔径的膜，缩短转移时间 甲醇浓度过高 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。或有非特异性条带 色带） 二抗的非特异性结合 增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。

可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。试剂不匹配 一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。

选择在有效期内、有活性的酶联物 标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的） 一抗的特异性不够 使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性 蛋白降解 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 二聚体或多聚体存在 增加蛋白质变性过程及强度 抗体浓度过高 降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带 蛋白上样量过大 降低上样量 封闭剂中有聚集体 使用前过滤封闭试剂 HRP耦联二抗中有聚集体 过滤二抗试剂，去除聚集体 HRP含量过高 降低酶联二抗的浓度

17日18时许，记者联系到四川可口可乐公司，一位相关人士称，上海出口的零度可口可乐原液主剂配料被查出含有禁用防腐剂，这一问题应该询问上海当地的公司，成都的零度可口可乐是在本地生产，均是经过严格检查，符合标准才出厂的。而此次台湾地区查出的原液每公斤含对羟基苯甲酸甲酯2.062克。